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Jun 10, 2023

Efectos de la adición de proteasas exógenas sobre la fermentación y el valor nutritivo de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7302 (2023) Citar este artículo 380 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics El objetivo del estudio fue evaluar los efectos de la adición de sustancias exógenas.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 7302 (2023) Citar este artículo

380 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

El objetivo del estudio fue evaluar los efectos de la adición de proteasa exógena sobre la fermentación y el valor nutritivo de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados durante varios períodos de almacenamiento. Los tratamientos se aplicaron mediante una combinación factorial 2 × 6 × 3, con 2 tipos de granos rehidratados (maíz y sorgo), 6 dosis de la enzima (0, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2 y 1,5%, en base a materia natural) y 3 periodos de fermentación (0, 60 y 90 días) en un diseño completamente al azar, con 4 repeticiones. Se utilizó la proteasa aspergilopepsina I, de origen fúngico, producida por Aspergillus niger. La concentración de ácido láctico aumentó linealmente a medida que aumentó la dosis de enzima en ensilajes de granos de maíz (CG) y sorgo (SG), a los 60 y 90 días de fermentación. Hubo un aumento en las concentraciones de nitrógeno amoniacal y proteína soluble, así como en la digestibilidad del almidón in situ en ensilajes rehidratados CG y SG, en comparación con el tratamiento sin adición de proteasa. La adición de 0,3% de proteasa exógena al momento del ensilado en CG y 0,5% en SG rehidratado incrementó la actividad proteolítica durante la fermentación, proporcionando un aumento en la digestibilidad in situ del almidón en un menor tiempo de almacenamiento.

El ensilaje de granos rehidratados es el producto resultante de la fermentación anaeróbica de granos maduros, molidos, con humedad reconstituida, en la que los microorganismos consumen carbohidratos solubles en agua y producen ácidos orgánicos de cadena corta. Es una tecnología de larga data1 que ha sido revivida en los últimos años2,3,4,5,6. En un estudio realizado en Brasil, Bernardes et al.7 mencionaron que el 52,4% de los productores de leche adoptaron ensilaje de granos (maíz o sorgo) en la dieta de los animales, el 16,6% correspondió a ensilaje de granos de maíz rehidratado.

El uso de esta tecnología ganó popularidad principalmente debido a los obstáculos comúnmente observados para el ensilaje de granos de maíz con alto contenido de humedad, por ejemplo, la estrecha ventana para cosechar granos húmedos. También permite compras estratégicas en tiempos de bajos precios del maíz. Adicionalmente, el almacenamiento de granos rehidratados como ensilaje puede eliminar o reducir el desarrollo de hongos y, en consecuencia, evitar la contaminación por micotoxinas en los materiales almacenados, así como se pueden lograr cambios positivos en el valor nutricional del alimento producido2,8,9 .

Durante el proceso de fermentación, las proteasas microbianas, así como los ácidos orgánicos producidos por las bacterias lácticas, promueven la solubilización de la matriz proteica que rodea los gránulos de almidón, aumentando la digestibilidad por los microorganismos ruminales3,10. Sin embargo, el ensilaje de granos rehidratado requiere tiempos de almacenamiento más prolongados para producir mayores aumentos en la digestibilidad de la materia seca5,11. Carvalho et al.11 informaron un aumento en la digestibilidad de la materia seca in vitro del ensilaje de grano de maíz rehidratado a los 280 días de almacenamiento en comparación con los 30, 60, 90 y 150 días de almacenamiento. Fernandes et al.12 observaron una mayor digestibilidad in situ del almidón del ensilaje de granos de maíz rehidratado después de 120 días de fermentación, en comparación con el maíz ensilado, con valores de 92,0 y 72,0%, respectivamente. Para el ensilaje de granos de sorgo rehidratado, Santos et al.13 observaron que las vacas alimentadas con dietas que contenían ensilajes almacenados durante 30 días tenían una menor digestibilidad del almidón (86,9%) en comparación con las vacas alimentadas con dietas con ensilajes almacenados durante 90 días (89,3%).

Las proteasas exógenas son aditivos prometedores que promueven mejoras nutricionales en el ensilaje de plantas de maíz14, los granos de maíz con alto contenido de humedad15 y los granos de maíz rehidratados16, en tiempos de almacenamiento más cortos, que oscilaron entre 30 y 70 días dependiendo del tipo de ensilaje y dosis de enzima utilizada. Las proteasas son enzimas que hidrolizan cadenas peptídicas en condiciones adecuadas de pH y temperatura, las cuales, durante la fermentación, proporcionan aumentos en las concentraciones de amoniaco y proteína soluble en ensilajes que presentan una correlación positiva con la digestibilidad del almidón, como lo reportan Ferrareto et al.17 y Kung et al.15.

Hasta la fecha, no existen reportes en la literatura sobre el uso de proteasas exógenas en el ensilaje de granos de sorgo rehidratados y, en Brasil, con granos de maíz rehidratados. La hipótesis de nuestro estudio es que la adición de proteasa exógena al ensilaje de granos de maíz y sorgo rehidratados favorece la solubilización de la fracción proteica y mejora la digestibilidad del almidón de los ensilajes en un menor tiempo de almacenamiento. Por lo tanto, el objetivo fue evaluar los efectos de la adición de proteasas exógenas sobre la fermentación y el valor nutricional de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados en diferentes períodos de almacenamiento.

El experimento se realizó en el Departamento de Ciencia Animal de la Universidad Federal de Viçosa (Universidad Federal de Viçosa—UFV, Viçosa, MG, Brasil). Viçosa está situada a 20°45′ de latitud sur, 42°51′ de longitud oeste y a 657 m sobre el nivel del mar, con una precipitación media anual de 1.341 mm.

Cincuenta kilogramos de granos de maíz (CG) y sorgo (SG) fueron obtenidos en la Universidad Federal de Viçosa, UFV y sometidos a molienda en un molino de martillos (DMP-2, Nogueiras, São João da Boa Vista, São Paulo, Brasil) con un tamiz de 3 mm. Luego, se reconstituyó la humedad del grano al 35%, con ayuda de una mezcladora de pienso para su homogeneización. Los granos de maíz y sorgo rehidratados se distribuyeron en 48 montones (24 montones CG y 24 montones SG), conteniendo 2,5 kg de granos rehidratados en cada montón.

El presente estudio cumple con las normas éticas brasileñas. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes para las plantas.

El producto comercial FoodPro PAL (PD 263063-3.0EN, DANISCO), una fuente de proteasa exógena, tiene una composición de (p/p) 50 % de glicerina, 32–40 % de agua, 10–12 % de aspergilopepsina I y 0– Sulfato de sodio al 2,8%. La aspergilopepsina es una proteasa de origen fúngico producida por Aspergillus niger que tiene actividad óptima a un pH de 2,5 a 3,0 y una temperatura de 55 a 60 °C, según lo especificado por el fabricante. Las cantidades del producto comercial referentes a las dosis evaluadas en el estudio se diluyeron en 50 mL de agua destilada y se aplicaron aleatoriamente sobre las pilas. Se roció la misma cantidad de agua sobre el tratamiento de control (0% de adición de enzima). El material se homogeneizó y se envasó 1 kg de grano de maíz y sorgo en bolsas de nailon y polietileno (25 x 35 cm; Doug Care Equipment Inc., Springville, CA), y se evacuó el aire de las bolsas utilizando un sellador al vacío ( Eco vacío 1040, Orved, Italia). Se prepararon dos bolsas en cada montón, haciendo referencia a 60 y 90 días de fermentación. Las bolsas se almacenaron en el laboratorio a temperatura ambiente. El material restante (500 g) del período cero se almacenó en bolsas de polietileno para su posterior análisis. Antes del ensilaje, se recolectaron muestras de granos secos y rehidratados para la caracterización del material (consulte la Tabla complementaria S1).

Se utilizó un esquema factorial 2 × 6 × 3, con 2 granos (maíz y sorgo), 6 dosis de la enzima (0, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2 y 1,5 % con base en NM) y 3 periodos de fermentación (0, 60, y 90 días) en un diseño completamente al azar, con 4 repeticiones.

Los extractos acuosos de las muestras de ensilaje o grano (día 0) se prepararon homogeneizando 25 g de muestra en 225 ml de solución estéril (Ringer Solution, Oxoid, Hampshire) en una licuadora industrial durante 1 min. Luego, el extracto se filtró a través de una doble capa de gasa estéril y se midió el pH con ayuda de un potenciómetro (Tecnal, SP, Brasil).

Una alícuota de 15 mL del extracto se filtró a través de papel de filtro Whatman 54 (Whatman, Florham, NJ) y se envasó en tubos que contenían 100 μL de H2SO4 al 50%, para su posterior análisis de nitrógeno amoniacal (NH3-N)18, carbohidratos solubles en agua ( WSC)19, ácido láctico (LA), ácido acético (AA), ácido butírico (BA) y etanol (ETA) mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, EE. UU.)20.

Se cuantificaron las poblaciones de bacterias ácido lácticas (BAL), enterobacterias (ENT), mohos y levaduras en los granos antes del ensilaje (día 0) y en los respectivos ensilajes. Una alícuota (10 ml) del extracto acuoso (25 g de grano/225 ml de solución salina estéril) se sometió a dilución seriada (10–1 a 10–8). Los microorganismos se cultivaron en placas de Petri estériles en De Man, Rogosa y Sharpe Ágar de LAB; Bilis Roja Violeta de ENT y Ágar Patata Dextrosa, suplementado con 1,5% de ácido tartárico al 10% (peso/vol), para mohos y levaduras, utilizando la técnica de recubrimiento en placa de vertido. Las placas se incubaron en una estufa, determinando la temperatura y el período para cada grupo de microorganismos de la siguiente manera: ENT, 37 °C/24 h; BAL, 37 °C/48 h; levaduras y mohos, 25 °C/72 y 120 h, respectivamente. Se contaron las placas con entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias (ufc).

Las muestras de granos antes del ensilaje y ensilaje se secaron en una estufa de ventilación forzada a 55 °C durante 72 h y luego se molieron en un molino Willey con tamiz de 1 mm. Se analizaron los contenidos de MS (método 934.01) y proteína cruda, PB (método 984.13) según AOAC21, fibra detergente neutra (FND) según Mertens22, almidón según Hall23 y proteína soluble total (P-sol) obtenida tras tratar el muestras con tampón borato fosfato (BPB), donde los valores de P-sol correspondieron a las fracciones A y B1, obtenidos de la diferencia entre el nitrógeno total y el nitrógeno insoluble en BPB según Licitra et al.24.

Para el ensayo de digestibilidad del almidón ruminal in situ (ISSD), se pesó individualmente una muestra de aproximadamente 5,0 g (tamaño de partícula de 3 mm) de cada tratamiento en bolsas de nailon (Sefar Nitex, Suiza; porosidad 50 μm, 400 cm2 de superficie) y se incubó en 4 Bovinos Nellore, con peso promedio de 300 ± 18 kg, provistos de cánula en rumen. Después de 7 h de incubación, las bolsas se retiraron del rumen y se lavaron con agua corriente hasta que el agua salió clara. Luego, se mantuvieron durante 72 h en una estufa ventilada a 55 °C, seguido de 2 h en una estufa a 105 °C, y luego se pesaron. El residuo de cada bolsa de nailon se eliminó y se molió en un molino de cuchillas (Tecnal, Piracicaba, São Paulo, Brasil) con un tamiz de 1 mm y se colocó en bolsas de polietileno para su posterior análisis de almidón residual según Hall23.

Quince días antes de la incubación, los animales utilizados en la prueba recibieron una dieta que contenía 50% de ensilaje de maíz y 50% de concentrado, en base seca.

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por las normas del Comité de Ética para el Uso de Animales de Producción de la UFV (CEUAP/UFV, protocolo nº 037/2018). Los métodos también cumplieron con las pautas de informes de experimentos in vivo de investigación con animales (ARRIVE) para la presentación de informes de experimentos con animales.

Los datos de ácidos orgánicos y etanol se analizaron en un esquema factorial 2 × 6 × 2, en el que no se consideró el período de fermentación 0 (cero); las demás variables se analizaron en un esquema factorial 2 × 6 × 3, en un diseño completamente al azar. El tipo de grano (G), las dosis de enzima (E) y los períodos de fermentación (P), así como las interacciones entre factores, se consideraron efectos fijos según el modelo:

donde, Yijk = variable de respuesta; µ = constante general; Gi = efecto de grano i; Ej = efecto enzimático j; (GE)ij = interacción del grano i y la enzima j; (GP)ik = interacción del grano i y el período k; (EP)jk = interacción de la enzima j y el período k; (GEP)ijk = interacción del grano i, la enzima j y el período k; y eijkl = error aleatorio suponiendo una distribución normal independiente, NID (0,σ2). Tras el análisis de varianza, se determinaron las interacciones significativas y se compararon las medias mediante la prueba de Tukey. El factor enzimático se analizó mediante análisis de regresión y las ecuaciones se eligieron en función de sus coeficientes de determinación (R2) y la significancia de los coeficientes de regresión. El nivel crítico de probabilidad de error tipo I adoptado fue 0.05, mediante el PROC MIXED de SAS versión 9.425. Para las variables P-sol, NH3-N, ISSD y FDN, los promedios estimados por el modelo (1) se ajustaron a un modelo polinómico cuadrático con respuesta meseta utilizando el procedimiento PROC NLIN de SAS versión 9.4, según las ecuaciones:

donde, Y = contenido variable en función de la dosis x de enzima; p = meseta; a, byc = parámetros estimados del modelo. Por lo tanto, para valores de x menores que x0, el modelo que describe la respuesta Y es una función cuadrática, y para valores de x mayores o iguales a x0, la ecuación es una constante o meseta.

Hubo un efecto (P <0,01) de la interacción G × E × P sobre LA, NH3-N y levaduras. Las variables pH, ETA y LAB se vieron afectadas (P < 0,05) por la interacción G × E, G × P y E × P, mientras que AA se vio afectada (P = 0,02) solo por E (Tabla 1).

Hubo un aumento lineal en las concentraciones de LA (P < 0,01) con un aumento en las dosis de enzima en los ensilajes CG y SG registrando valores de 32,03 y 32,25 g/kg de MS a los 60 días y 31,36 y 32 0,60 g/kg de MS a los 90 días. de fermentación a una dosis del 1,5%, respectivamente (Fig. 1). La concentración de AA observada en los ensilajes se ajustó a un modelo cuadrático (P = 0,008) (Fig. 1).

Análisis de regresión para las concentraciones de ácido láctico afectadas por la interacción G × E × P (a, P = 0,0008, SEM = 0,705) y efecto enzimático para las concentraciones de ácido acético (b, P = 0,019, SEM = 0,271) en ensilaje de grano de sorgo y maíz rehidratado , tratados o no, con enzima en diferentes periodos de fermentación. CG = grano de maíz; GS = grano de sorgo; P = periodo (60 y 90 días).

Los ensilajes de CG y SG mostraron concentraciones de ETA similares, excepto en dosis de 1,2% (P = 0,02) y 1,5% (P = 0,008) de enzima, en las que los ensilajes de SG mostraron concentraciones más altas que los de CG (ver Figura complementaria S1). No se detectó la presencia de BA en los ensilajes evaluados en el presente estudio, y no se observaron poblaciones de enterobacterias ni mohos en los ensilajes.

Al momento del ensilaje, el SG tuvo una población de BAL mayor (P < 0,01), pero a los 60 (P = 0,34) y 90 (P = 0,67) días de fermentación, no hubo diferencia en comparación con los ensilajes CG. En ambos ensilajes, las poblaciones de LAB más altas (P <0,01) se registraron a los 60 días de fermentación en comparación con los períodos 0 (cero) y 90 días (ver Figura complementaria S2). Los ensilajes SG mostraron poblaciones de levadura más altas (P <0,05) que los ensilajes CG a los 60 y 90 días de fermentación, excepto los ensilajes con dosis de enzima de 0 y 1,2% (ver Figura complementaria S2).

Los datos observados para la concentración de NH3-N en ensilajes de CG y SG (Fig. 2) se ajustaron a un modelo polinomial cuadrático con una respuesta de meseta. Se observaron aumentos en las concentraciones de NH3-N hasta dosis de 0,75% (P < 0,001) y 0,50% (P = 0,006) de enzima en ensilajes CG y 0,80 (P = 0,002) y 0,59% (P = 0,004) en ensilajes SG en 60 y 90 días de fermentación, respectivamente, con posterior estabilización de las concentraciones de NH3-N en ensilajes (Fig. 2). Hubo aumentos de aproximadamente 8,88 y 11,05 veces en las concentraciones de NH3-N en el ensilaje CG; y aumentos de 19,43 y 25,14 veces en ensilaje SG a los 60 y 90 días de fermentación, respectivamente (Fig. 2).

Concentraciones de nitrógeno amoniacal en ensilajes de granos de maíz (a) y sorgo (b) rehidratados, tratados o no, con enzima en diferentes periodos de fermentación. Grano de maíz (a) P0: Y = 0,428 − 0,55x + 1,02x2, se x < 0,27 e Y = 0,36, se x ≥ 0,27, R2 = 0,64, P60: Y = 3,84 + 15,86x − 10,63x2, se x < 0,75 e Y = 9,75, se x ≥ 0,75, R2 = 0,99, P90: Y = 4,75 + 22,52x − 21,57x2, se x < 0,52 e Y = 10,62, se x ≥ 0,52, R2 = 0,96. Grano de sorgo (b) P0: Y = 0,13 + 0,24x − 0,17x2, se x < 0,70 e Y = 0,21, se x ≥ 0,70, R2 = 0,41, P60: Y = 2,84 + 16,10x − 10,03x2, se x < 0,80 e Y = 9,30, se x ≥ 0,80, R 2 = 0,98, P90: Y = 3,52 + 25,38x − 21,47x2, se x < 0,59 e Y = 11,02, se x ≥ 0,59, R2 = 0,97.

Hubo efecto de la interacción G × E × P sobre todas las variables del valor nutricional de los ensilajes, excepto la MS, que fue afectada por las interacciones G × P (P = 0.01) y E × P (P < 0.01). , mientras que la PC se vio afectada por los factores G y P (Tabla 2).

Las concentraciones de WSC observadas para CG en el momento del ensilaje (P0) y en el ensilaje a los 60 días de fermentación fueron mayores (P <0,01) que las observadas para SG en todas las dosis de enzima (ver Figura complementaria S3). Un resultado similar se observó para las concentraciones de almidón, en las que CG presentó valores mayores (P < 0,05) que SG al momento del ensilaje. A los 60 y 90 días de fermentación, las concentraciones de almidón en los ensilajes de CG también fueron mayores, excepto en dosis de 0% (cero), 0,6% y 1,5% de enzima (ver Figura complementaria S3).

La variable PC se vio afectada por los factores G (P < 0,01) y P (P < 0,01) (Tabla 2). Los ensilajes SG mostraron valores mayores (P < 0,01) que los ensilajes CG, con valores de 100,9 y 86,1 g/kg MS, respectivamente. A los 60 y 90 días de fermentación se observó un valor menor (P < 0.01) para esta variable en comparación con el período 0 (cero), con valores de 90.1, 90.2 y 100.1, respectivamente. Aunque el tratamiento con proteasa exógena no afectó (P = 0,35) la concentración de PB de los ensilajes rehidratados de CG y SG, el P-sol se vio afectado (P < 0,01) por la interacción G × E × P (Tabla 2), cuyos datos se ajustaron a un modelo polinómico cuadrático con respuesta de meseta, excepto para el grano de sorgo en el período cero (SGP0), que aumentó linealmente con la dosis de enzima (Fig. 3). Se observaron aumentos en las concentraciones de P-sol hasta dosis de 0,45% y 0,37% de enzima en ensilados CG, con respuestas meseta de 88,29% y 93,94% de PB, y 0,50 y 0,53% en ensilajes SG, con respuestas meseta de 83,83% y 87,81% de PB a los 60 y 90 días de fermentación, respectivamente (Fig. 3).

Concentraciones de proteína soluble (P-sol) en tampón borato fosfato (BPB) de ensilajes de granos de maíz (a) y sorgo (b) rehidratados, no tratados y tratados con enzima en diferentes períodos de fermentación. Granos de maíz (a) P0: Y = 25,22 + 13,04x − 3,96x2, si x < 1,65 e Y = 35,96, si x ≥ 1,65, R2 = 0,97, P60: Y = 40,83 + 209,39x − 230,95x2, si x < 0,45 e Y = 88,29, si x ≥ 0,45, R2 = 0,99, P90: Y = 52,99 + 222,32x − 301,75x2, si x < 0,37 e Y = 93,94, si x ≥ 0,37, R2 = 0,99. Grano de sorgo (b) P0: Y = 6,3915x + 15,36, R2 = 0,80, P60: Y = 33,25 + 204,48x − 202,67x2, si x < 0,50 e Y = 83,83, si x ≥ 0,50, R2 = 0,99, P90: Y = 38,29 + 187,27x − 177,04x2, si x < 0,53 e Y = 87,81, si x ≥ 0,53, R2 = 0,99.

Se observó un efecto (P <0,01) de la interacción G × E × P sobre la FDN (Tabla 2). Los datos NDF se ajustaron a modelos polinomiales cuadráticos con una respuesta de meseta. Se observó que el ensilaje SG requirió dosis de enzimas más bajas a los 60 y 90 días de fermentación para obtener una respuesta estable en comparación con el ensilado CG (Fig. 4).

Concentraciones de fibra detergente neutra (FDN) de ensilajes de granos de maíz (a) y sorgo (b) rehidratados, sin tratar y tratados con proteasa exógena en diferentes períodos de fermentación. Granos de maíz (a) P0: Y = 163,97 − 61,82x + 27,71x2, si x < 1,12 e Y = 129,49, si x ≥ 1,12, R2 = 0,88, P60: Y = 94,89 − 39,24x + 32,35x2, si x < 0,61 e Y = 82,99, si x ≥ 0,61, R2 = 0,89, P90: Y = 81,81 − 7,44x + 2,77x2, si x < 1,34 e Y = 76,81, si x ≥ 1,34, R2 = 0,27. Granos de sorgo (b) P0: Y = 156,33 − 39,76x + 13,39x2, si x < 1,48 e Y = 126,82, si x ≥ 1,48, R2 = 0,90, P60: Y = 114,95 − 155,69x + 176,19x2, si x < 0,44 e Y = 80,56, si x ≥ 0,44, R2 = 0,99, P90: Y = 85,86 − 61,79x + 54,86x2, si x < 0,56 e Y = 68,47, si x ≥ 0,56, R2 = 0,93.

Para la variable ISSD, hubo una interacción G × E × P (P < 0,01) (Tabla 2), y los datos se ajustaron a un modelo polinómico cuadrático con una respuesta de meseta a dosis de 0,29 % y 0,30 % de enzima en ensilajes de CG. y 0,50% y 0,44% en ensilajes SG, lo que proporcionó aumentos en la digestibilidad del almidón de aproximadamente 44,9% (648,39 vs 939,62 g/kg de almidón) y 43% (676,81 vs 967,42 g/kg de almidón) en ensilajes CG y 69,6 (346,53 vs 587,88 g/kg de almidón) y 66,7% (376,99 vs 628,57 g/kg de almidón) en ensilajes SG, a los 60 y 90 días de fermentación, respectivamente (Fig. 5). A pesar de los mayores aumentos en los ensilajes SG, los ensilajes CG presentaron valores ISSD numéricamente más altos (Fig. 5). Independientemente del período de fermentación, basado en el modelo cuadrático de respuesta meseta, la dosis de 0,30% de enzima proporcionó la máxima digestibilidad del almidón en el ensilaje CG, mientras que para el ensilado SG la digestibilidad del almidón alcanzó un valor máximo en dosis de 0,50% y 0,44%. cuando se almacena durante 60 y 90 días, respectivamente (Fig. 5).

Digestibilidad in situ del almidón (ISSD) de ensilajes de granos de maíz (a) y sorgo (b) rehidratados, no tratados y enzimáticos en diferentes períodos de fermentación. Granos de maíz (a) P0: Y = 418,53 + 371,14x − 488,7x2, si x < 0,38 e Y = 489,001, si x ≥ 0,38, R2 = 0,83, P60: Y = 648,39 + 2003,25x − 3444,9x2, si x < 0,29 e Y = 939,62, si x ≥ 0,290, R2 = 0,99, P90: Y = 676,81 + 1767,55x − 2687,7x2, si x < 0,30 e Y = 967,424, si x ≥ 0,328, R2 = 0,99. Granos de sorgo (b) P0: Y = 312,05 − 40,67x + 16,80x2, si x < 1,21 e Y = 287,43, si x ≥ 1,21, R2 = 0,14, P60: Y = 346,53 + 994,91x − 1025,4x2, si x < 0,49 e Y = 587,88, si x ≥ 0,49, R2 = 0,97, P90: Y = 376,99 + 1150,81x − 1316,1x2, si x < 0,44 e Y = 628,57, si x ≥ 0,44, R2 = 0,97.

La concentración inicial de WSC tiene un efecto importante en la tasa de disminución del pH durante el ensilaje, ya que es el sustrato utilizado para el metabolismo de las BAL. Las bajas concentraciones de WSC de los granos antes del ensilaje (ver Tabla complementaria S1) no limitaron el crecimiento de LAB (ver Figura complementaria S2) o el proceso de fermentación, ya que los valores de pH observados en los ensilajes en los días 60 y 90 de fermentación, que varió de 3,93 a 4,02, podría considerarse adecuado para los ensilajes evaluados (ver Figura complementaria S4). El pH se ve directamente afectado por la concentración de ácidos orgánicos producidos por las BAL, siendo considerado el LA el más eficaz para reducir el pH durante la fermentación26. El aumento lineal de las concentraciones de LA, en nuestro estudio (Fig. 1), se debió probablemente a que la adición de proteasa exógena incrementó la proteólisis y, en consecuencia, proporcionó una mayor liberación de péptidos y aminoácidos libres, que favorecen el crecimiento de los ácidos lácticos. bacterias productoras de ácido16,27,28.

El valor mínimo estimado de ácido acético de 0,79 g/kg MS, a una dosis de 0,9% de la enzima (Fig. 1), puede considerarse adecuado con base en las concentraciones recomendadas para este ácido, en ensilajes de granos de maíz con alto contenido de humedad, informó por Kung et al.26. Young et al.28 informaron un aumento en la concentración de AA en ensilaje de maíz tratado con proteasa exógena a los 150 días de fermentación. Sin embargo, Kung et al.15 y Ferrareto et al.16 no encontraron ningún efecto sobre la adición de proteasa en ensilaje de grano de maíz con alto contenido de humedad o ensilaje de grano de maíz rehidratado, respectivamente.

En el presente estudio, independientemente de la dosis y el período de fermentación, ambos ensilajes presentaron concentraciones de ETA dentro del rango (2-20 g/kg MS) propuesto por Kung et al.26 para ensilajes de granos de maíz con alto contenido de humedad. Las levaduras son los principales microorganismos responsables de producir etanol durante la fermentación27 (consulte las figuras complementarias S1 y S2).

La no detección de enterobacterias a los 60 y 90 días de fermentación probablemente se debió al pH de la masa ensilada, ya que este grupo microbiano es sensible al pH bajo, como lo sugieren Pahlow et al.27. En cuanto a los mohos, durante el ensilado, estos se desarrollan al principio del proceso, cuando aún queda oxígeno dentro del silo. Sin embargo, durante la fermentación, la ausencia de oxígeno asociada a la presencia de ácidos orgánicos inhibe el crecimiento de estos microorganismos29,30, como se observa en el presente estudio. Esto demuestra la eficacia de las BAL epífitas (ver Fig. S2 complementaria), que producen ácidos orgánicos responsables de reducir el pH26, en el proceso de fermentación y de controlar los microorganismos indeseables durante la fermentación, como las enterobacterias y el moho. Un comportamiento similar fue reportado por Fernandes et al.5 en ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados, quienes no verificaron la presencia de moho cuando se abrieron los silos experimentales.

Cuando se ensilan forrajes y granos, las proteínas se degradan naturalmente en péptidos y aminoácidos libres, y la desaminación de los aminoácidos puede conducir a un aumento del NH3-N en la masa ensilada debido a la acción de enzimas microbianas y vegetales10,31, esto explica la aumentos en las concentraciones de NH3-N en ensilajes de CG y SG a los 60 y 90 días de fermentación (Fig. 2). Kung et al.15 sugirieron la inclusión de proteasa exógena en el ensilaje de maíz con alto contenido de humedad para aumentar la proteólisis, que anteriormente se consideraba indeseable en el proceso de fermentación28. Los aumentos sustanciales en las concentraciones de NH3-N en los ensilajes de CG y SG (Fig. 2) confirmaron la efectividad de la proteasa exógena utilizada en el presente estudio en la degradación de las prolaminas que rodean los gránulos de almidón, haciendo que el almidón sea más digerible por los microorganismos del rumen32. Así, la concentración de NH3-N es un parámetro indicativo de proteólisis, lo que implica una posible mejora en la digestibilidad del almidón, ya que presenta una correlación lineal positiva (P < 0,001) con la digestibilidad15,17, lo cual fue confirmado en el presente estudio (ver Figura complementaria S5).

El menor contenido de MS a los 90 días de fermentación en comparación con los 60 días, excepto por la dosis del 0,3% de la enzima (ver Figura complementaria S6), probablemente se debió a la actividad microbiana durante el proceso de fermentación, que naturalmente promueve reducciones en los contenidos de MS con avanzando el tiempo de ensilaje, como lo verificaron Carvalho et al.11 y Da Silva et al.3 en ensilajes CG y Santos et al.13 en ensilaje SG rehidratado.

La cantidad de PC solubilizada observada en nuestro estudio indica que la actividad proteolítica ocurrió naturalmente en CG y SG durante la fermentación, como informaron Hoffman et al.32 y Junges et al.10. Sin embargo, esta actividad aumenta con la adición de proteasa exógena (Fig. 3), como lo observaron Kung et al.15 en ensilaje de grano de maíz con alto contenido de humedad y Ferrareto et al.16 en ensilajes transgénicos rehidratados. Por lo tanto, con base en los resultados de nuestro estudio, se puede confirmar que P-sol es un parámetro indicativo de la actividad proteolítica, ya que mejora la digestibilidad del almidón, mostrando una correlación lineal positiva con la digestibilidad (ver Figura complementaria S5), como destacan Ferrareto et al. al.17 y Kung et al.15.

Un hallazgo interesante en nuestro estudio fue la reducción de las concentraciones de FND a los 60 y 90 días de fermentación en comparación con el período 0 (cero) con dosis crecientes de la enzima en ensilajes de ambos granos (Fig. 4). Una posible explicación para esta reducción sería la solubilización de los componentes de la pared celular por la actividad de enzimas tolerantes a los ácidos presentes en los granos ensilados33, lo que posiblemente contribuyó al aumento de la concentración de WSC durante la fermentación34 (ver Figura complementaria S3). Young et al.28 también observaron reducciones en las concentraciones de FND en ensilaje de plantas de maíz enteras tratadas con proteasa en función del tiempo de almacenamiento. Las proteasas pueden eliminar proteínas estructurales en la pared celular de la planta, lo que resulta en un acceso más rápido a la celulosa y hemicelulosa por parte de los microorganismos del rumen35, lo que probablemente también contribuye al aumento de las concentraciones de P-sol de los ensilajes tratados en nuestro estudio. Estos autores observaron que la adición de proteasa a la ración antes de alimentar a los animales mejoraba la digestibilidad del FND.

Las proteínas que rodean los gránulos de almidón en los granos representan una barrera fisicoquímica para los microorganismos amilolíticos en el rumen, lo que limita la digestión del almidón32. Kung et al.15 destacaron la proteólisis como el principal mecanismo para aumentar la digestión del almidón ruminal en ensilajes con fuente de almidón, debido a que durante la fermentación ocurre la solubilización de la matriz proteica, lo que aumenta la superficie de contacto para la acción de los microorganismos ruminales, como se observó. en nuestro estudio y en otros previos2,16,32. La dosis más alta de enzima para proporcionar la máxima digestibilidad del almidón para el ensilaje SG observada en el presente estudio (Fig. 5) probablemente se justifica por el hecho de que el grano de sorgo presenta una mayor proporción de proteínas en el endospermo periférico que el grano de maíz, lo que aumenta resistencia a la penetración de agua, haciéndolo más resistente a la degradación enzimática36, proporcionando así menor P-sol en comparación con el de CG, tanto antes como después de la fermentación. Además, los factores antinutricionales pueden reducir la digestibilidad intestinal y total del sorgo en rumiantes37.

Cabe mencionar que la estabilidad de las enzimas y su capacidad para interactuar adecuadamente con el sustrato objetivo es un factor que puede proporcionar respuestas inconsistentes al utilizar este aditivo en ensilaje. Cada enzima tiene una temperatura y un rango de pH óptimos, y actúa de manera más eficiente cuando las condiciones son cercanas a las ideales38,39. Por lo tanto, las respuestas obtenidas con el uso de la enzima en ensilajes CG y SG, en las condiciones actuales, apoyan nuestra hipótesis de que la adición de proteasa aumenta la digestibilidad del almidón.

En conclusión, la adición de 0,30% de proteasa exógena al momento del ensilado en CG y 0,50% en SG rehidratado favoreció la actividad proteolítica durante la fermentación y proporcionó un aumento en la digestibilidad in situ del almidón en un menor tiempo de almacenamiento. Una implicación práctica es que, si bien el sorgo es una opción interesante frente al maíz, considerando que se encuentra en su precio de comercialización más bajo histórico, el sorgo requiere una dosis 66,6% mayor que la del maíz para maximizar la digestibilidad del almidón después de 60 días de fermentación. Este hecho debe tenerse en cuenta a la hora de elegir el tipo de grano a rehidratar y ensilar. Sin embargo, es de destacar que los ensilajes CG presentaron valores ISSD más altos que los ensilajes SG. Existe la necesidad de realizar estudios para evaluar el desempeño de rumiantes alimentados con estos ensilajes, y el costo beneficio de la adición de proteasa exógena, al momento del ensilaje.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Mclaren, RJ & Matsushima, K. Digestión de maíz reconstituido ensilado. J.Anim. Ciencia. 27, 1171 (1968).

Google Académico

Ferrareto, LF, Silva Filho, WI, Fernandes, T., Kim, DH y Sultana, H. Efecto del tiempo de ensilaje sobre el perfil de fermentación y la digestibilidad ruminal del almidón in vitro en maíz rehidratado con o sin concentraciones variadas de granos cerveceros húmedos. J. Ciencia láctea. 101, 4643–4649. https://doi.org/10.3168/jds.2017-14329 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Da Silva, NC et al. Fermentación y estabilidad aeróbica de ensilaje de granos de maíz rehidratados tratados con diferentes dosis de Lactobacillus buchneri o una combinación de Lactobacillus plantarum y Pediococcus acidilactici. J. Ciencia láctea. 101, 4158–4167. https://doi.org/10.3168/jds.2017-13797 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Silva, BC et al. Grano de maíz o sorgo reconstituido y ensilado: impactos en las fracciones de nitrógeno de la dieta, la ingesta y los sitios de digestión en toros Nellore jóvenes. MÁS UNO 15, 1–17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0237381 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Fernández, T. et al. Efecto de las amilasas y la duración del almacenamiento sobre las pérdidas, el valor nutricional, la fermentación y la microbiología de ensilajes de granos de maíz y sorgo. Animación. Alimentar ciencia. Tecnología. 285, 115–227. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2022.115227 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Agarussi, MCN et al. Microbioma de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados tratados con inoculantes microbianos en diferentes períodos de fermentación. Ciencia. Rep. 12, 1-17. https://doi.org/10.1038/s41598-022-21461-4 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Bernardes, TF, Cardoso, MVS & Lima, LM Programas de alimentación con ensilaje en explotaciones lecheras intensivas. J. Ciencia láctea. 2, 257 (2018).

Google Académico

Reis, W. y col. Comportamiento de corderos terminados en confinamiento, consumiendo ensilajes de maíz con granos de alta humedad o granos de maíz hidratados reemplazando en la dieta los granos de maíz secos. R. Bras. Zootec. 30, 596–603. https://doi.org/10.1590/S1516-35982001000200040 (2001).

Artículo de Google Scholar

Daniel, JLP, Bernardes, TF, Jobim, CC, Schmidt, P. & Nussio, LG Producción y utilización de ensilajes en áreas tropicales con enfoque en Brasil. Ciencia del forraje de pasto. 74, 188–200. https://doi.org/10.1111/gfs.12417 (2018).

Artículo de Google Scholar

Junges, D. y col. Comunicación breve: Influencia de diversas fuentes proteolíticas durante la fermentación de ensilajes de granos de maíz reconstituidos. J. Ciencia láctea. 100, 9048–9051. https://doi.org/10.3168/jds.2017-12943 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Carvalho, BF et al. Perfil de fermentación e identificación de bacterias ácido lácticas y levaduras de ensilaje de granos de maíz rehidratados. J. Aplica. Microbiol. 122, 589–600. https://doi.org/10.1111/jam.13371 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fernández, J. et al. Influencia del híbrido, la humedad y la duración del almacenamiento en el perfil de fermentación y la digestibilidad del almidón de ensilajes de granos de maíz. Animación. Alimentar ciencia. Tecnología. 271, 1–11. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2020.114707 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Santos, WP et al. El efecto de la duración del almacenamiento y el benzoato de sodio sobre el valor nutritivo de los ensilajes de granos de sorgo reconstituidos para vacas lecheras. J. Ciencia láctea. 102, 9028–9038. https://doi.org/10.3168/jds.2019-16759 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Windle, MC, Walker, N. & Kung, L. Jr. Efectos de una proteasa exógena sobre la fermentación y el valor nutritivo del ensilaje de maíz cosechado con diferentes contenidos de materia seca y ensilado durante varios períodos de tiempo. J. Ciencia láctea. 97, 3053–3060. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7586 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kung, L. Jr., Windle, MC y Walker, N. El efecto de una proteasa exógena sobre la fermentación y el valor nutritivo del maíz con alto contenido de humedad. J. Ciencia láctea. 97, 1707-1712. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7469 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ferrareto, LF, Fredin, SM & Shaver, RD Influencia del ensilaje, la adición de proteasas exógenas y la inoculación bacteriana en el perfil de fermentación, las fracciones de nitrógeno y la digestibilidad ruminal del almidón in vitro en maíz rehidratado y con alto contenido de humedad. J. Ciencia láctea. 98, 7318–7327. https://doi.org/10.3168/jds.2015-9891 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Ferraretto, LF, Taysom, K., Taysom, D., Shaver, RD y Hoffman, PC Relaciones entre el contenido de materia seca, el ensilaje, el nitrógeno amoniacal y la digestibilidad ruminal del almidón in vitro en muestras de maíz con alto contenido de humedad. J. Ciencia láctea. 97, 3221–3227. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7680 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Okuda, H., Fujii, S. y Kawashima, Y. Una determinación colorimétrica directa de amoníaco en sangre. Tokushima J. Exp. Medicina. Puede. 12, 11-23 (1965).

CAS Google Académico

Nelson, N. Una adaptación fotométrica del método Somogyi para la determinación de glucosa. J. Biol. Química. 153, 375–380 (1944).

Artículo CAS Google Scholar

Siegfried, VR, Ruckemann, H. & Stumpf, G. Método para la determinación de ácidos orgánicos en ensilaje mediante cromatografía líquida de alta resolución. Landwirtsch. Forsch. 37, 298–304 (1984).

CAS Google Académico

AOAC. Asociación Oficial de Química Analítica (1990).

Mertens, DR Determinación gravimétrica de fibra detergente neutra tratada con amilasa en alimentos con reflujo en vaso de precipitados o crisoles: estudio colaborativo. J. AOAC Int. 85, 1217-1240. https://doi.org/10.1093/jaoac/85.6.1217 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hall, MB Determinación de almidón dietético en piensos y alimentos para mascotas mediante un método enzimático-colorimétrico: estudio colaborativo. J. AOAC Int. 98, 397–409. https://doi.org/10.5740/jaoacint.15-012 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Licitra, G., Hernandez, TM & Van Soest, PJ Estandarización de procedimientos para el fraccionamiento de nitrógeno de alimentos para rumiantes. Animación. Alimentar ciencia. Tecnología. 57, 347–358. https://doi.org/10.1016/0377-8401(95)00837-3 (1996).

Artículo de Google Scholar

Instituto SAS Inc. Versión 9.4. Guía de Procedimientos (SAS Institute Inc, 2013).

Google Académico

Kung, L. Jr., Shaver, R., Grant, RJ y Schmidt, RJ Revisión del ensilaje: interpretación de los componentes químicos, microbianos y organolépticos de los ensilajes. J. Ciencia láctea. 101, 4020–4033. https://doi.org/10.3168/jds.2017-13909 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pahlow, G., Muck, RE, Driehuis, F., Oude Elferink, SJWH y Spoelstra, SF Microbiología del ensilaje. En Ciencia y tecnología del ensilaje (Sociedad Estadounidense de Agronomía, 2003).

Google Académico

Young, KM, Lim, JM, Der Bedrosian, MC & Kung, L. Jr. Efecto de las enzimas proteasas exógenas sobre la fermentación y el valor nutritivo del ensilaje de maíz. J. Ciencia láctea. 95, 6687–6694. https://doi.org/10.3168/jds.2012-5628 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Woolford, MK La fermentación del ensilaje (Marcel Dekker, 1984).

Google Académico

McDonald, P., Henderson, AR y Heron, SJE Bioquímica del ensilaje (Publicaciones Marlow Chalcombe, 1991).

Google Académico

Rooke, JA & Hatfield, RD Bioquímica del ensilaje. En Ciencia y tecnología del ensilaje (Sociedad Estadounidense de Agronomía, 2003).

Google Académico

Hoffman, PC y cols. Influencia del tiempo de ensilaje y de la inoculación en la alteración de la matriz proteica del almidón en maíz con alto contenido de humedad. J. Ciencia láctea. 94, 2465–2474. https://doi.org/10.3168/jds.2010-3562 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Der Bedrosian, MC, Nestor, KE & Kung, L. Jr. Los efectos del híbrido, la madurez y la duración del almacenamiento sobre la composición y el valor nutritivo del ensilaje de maíz. J. Ciencia láctea. 95, 5115–5126. https://doi.org/10.3168/jds.2011-4833 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Ribeiro, JL et al. Valor nutritivo de ensilajes de pasto marandú sometidos a los efectos de la humedad, la inoculación bacteriana y la estación. R. Bras. Zootec. 37, 1176–1184. https://doi.org/10.1590/S1516-35982008000700006 (2008).

Artículo de Google Scholar

Colombatto, D. & Beauchemin, KA Un aditivo de proteasa aumenta la fermentación de dietas de alfalfa mediante microorganismos ruminales mixtos in vitro. J.Anim. Ciencia. 87, 1097–1105. https://doi.org/10.2527/jas.2008-1262 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rooney, LW & Pflugfelder, RL Factores que afectan la digestibilidad del almidón con especial énfasis en sorgo y maíz. J.Anim. Ciencia. 63, 1607–1623. https://doi.org/10.2527/jas1986.6351607x (1986).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Silva, BC et al. Técnicas in situ e in vitro para la estimación de parámetros de degradación y digestibilidad de dietas basadas en maíz o sorgo. J. Agrícola. Ciencia. 158, 150–158. https://doi.org/10.1017/S0021859620000271 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Lehninger, L., Nelson, DL y Cox, MM Principios de bioquímica (Worth Publishers, 1993).

Google Académico

Muck, RE y cols. Revisión de ensilaje: avances recientes y usos futuros de los aditivos de ensilaje. J. Ciencia láctea. 101, 3980–4000. https://doi.org/10.3168/jds.2017-13839 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

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Agradecemos al CNPq, CAPES, INCT-CA y FAPEMIG por su apoyo financiero.

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João Paulo Santos Roseira, Odilon Gomes Pereira, Tâmara Chagas da Silveira, Vanessa Paula da Silva, Wagner Sousa Alves, Mariele Cristina Nascimento Agarussi y Karina Guimarães Ribeiro

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JPSR realizó el experimento, analiza y preparó el manuscrito. OGP diseñó el experimento y contribuyó a la redacción del manuscrito. TCS realizó los análisis de composición química. VPS realizó los análisis microbiológicos. WSA realizó los análisis in situ. MCNA realizó los análisis de almidón y KGR contribuyó a la redacción del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Odilon Gomes Pereira.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Roseira, JPS, Pereira, OG, da Silveira, TC et al. Efectos de la adición de proteasas exógenas sobre la fermentación y el valor nutritivo de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados. Representante científico 13, 7302 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34595-w

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Recibido: 08 de marzo de 2023

Aceptado: 04 de mayo de 2023

Publicado: 05 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34595-w

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